রিয়েল-টাইম ফ্লুরোসেন্স কোয়ান্টিটেটিভ পিসিআর নীতি কৌশল এবং অ্যাপ্লিকেশন

সাধারণভাবে, ফ্লুরোসেন্স অ্যামপ্লিফিকেশন কার্ভকে তিনটি ধাপে ভাগ করা যায়: ফ্লুরোসেন্স ব্যাকগ্রাউন্ড সিগন্যাল ফেজ, ফ্লুরোসেন্স সিগন্যাল এক্সপোনেনশিয়াল অ্যামপ্লিফিকেশন ফেজ এবং মালভূমি ফেজ।ব্যাকগ্রাউন্ড সিগন্যাল ফেজ চলাকালীন, অ্যামপ্লিফাইড ফ্লুরোসেন্স সিগন্যাল ফ্লুরোসেন্স ব্যাকগ্রাউন্ড সিগন্যাল দ্বারা মুখোশিত থাকে এবং পণ্যের পরিমাণের পরিবর্তন নির্ধারণ করা যায় না।মালভূমি পর্যায়ে, পরিবর্ধন পণ্যটি আর দ্রুতগতিতে বৃদ্ধি পায় না, শেষ পণ্যের পরিমাণ এবং প্রারম্ভিক টেমপ্লেট পরিমাণের মধ্যে কোন রৈখিক সম্পর্ক নেই এবং শুরুর ডিএনএ কপি নম্বর চূড়ান্ত পিসিআর পণ্যের পরিমাণের উপর ভিত্তি করে গণনা করা যায় না।শুধুমাত্র ফ্লুরোসেন্ট সিগন্যালের সূচকীয় পরিবর্ধন পর্বে পিসিআর পণ্যের পরিমাণের লগারিদম এবং শুরুর টেমপ্লেট পরিমাণের মধ্যে একটি রৈখিক সম্পর্ক রয়েছে এবং আমরা এই পর্যায়ে এটি পরিমাপ করতে বেছে নিতে পারি।পরিমাপ এবং তুলনার সুবিধার জন্য, রিয়েল-টাইম ফ্লুরোসেন্ট পরিমাণগত পিসিআর কৌশলে দুটি অত্যন্ত গুরুত্বপূর্ণ ধারণা চালু করা হয়েছে: ফ্লুরোসেন্স থ্রেশহোল্ড এবং সিটি মান।

থ্রেশহোল্ড হল ফ্লুরোসেন্স অ্যামপ্লিফিকেশন কার্ভের একটি কৃত্রিমভাবে সেট করা মান।PCR পরিবর্ধনের সূচকীয় পর্যায়।

Ct মান: প্রতিটি বিক্রিয়া টিউবের ফ্লুরোসেন্স সংকেত সেট ডোমেন মান পৌঁছাতে যে চক্রের সংখ্যা অতিক্রম করেছে।

Ct মান এবং প্রারম্ভিক টেমপ্লেটের মধ্যে সম্পর্ক: গবেষণায় দেখা গেছে যে প্রতিটি টেমপ্লেটের Ct মানের সাথে সেই টেমপ্লেটের প্রারম্ভিক কপি নম্বরের লগারিদমের সাথে একটি রৈখিক সম্পর্ক রয়েছে, প্রারম্ভিক কপি নম্বরের যত বেশি অনুলিপি হবে, Ct তত ছোট হবে। মানCt মান তুলনামূলকভাবে স্থিতিশীল।একটি পরিচিত প্রারম্ভিক কপি নম্বর সহ একটি স্ট্যান্ডার্ড ব্যবহার করে একটি আদর্শ বক্ররেখা তৈরি করা যেতে পারে, যেখানে অনুভূমিক স্থানাঙ্কটি প্রারম্ভিক কপি নম্বরের লগারিদমকে উপস্থাপন করে এবং উল্লম্ব স্থানাঙ্কটি নীচের চিত্রে দেখানো হিসাবে Ct মানকে উপস্থাপন করে।

অতএব, একটি অজানা নমুনার Ct মান প্রাপ্ত করে, সেই নমুনার প্রারম্ভিক কপি নম্বরটি আদর্শ বক্ররেখা থেকে গণনা করা যেতে পারে।

Ct মান ধ্রুবক নয় এবং বিভিন্ন নমুনা এবং বিভিন্ন যন্ত্র দ্বারা প্রভাবিত হতে পারে, এমনকি যদি একই নমুনা একই যন্ত্রে 2 বার পুনরাবৃত্তি হয়, Ct মান পরিবর্তিত হতে পারে।

পরিমাণগত ফ্লুরোসেন্স অ্যাস: পরিমাণগত ফ্লুরোসেন্স অ্যাসেগুলি ব্যবহৃত মার্কারগুলির উপর নির্ভর করে ফ্লুরোসেন্ট প্রোব এবং ফ্লুরোসেন্ট রঞ্জকগুলিতে বিভক্ত করা যেতে পারে।ফ্লুরোসেন্ট প্রোবের মধ্যে রয়েছে বীকন প্রযুক্তি (আণবিক বীকন প্রযুক্তি, আমেরিকান ট্যাগি দ্বারা প্রতিনিধিত্ব করে), TaqMan প্রোব (ABI দ্বারা প্রতিনিধিত্ব করে) এবং FRET প্রযুক্তি (রোচে প্রতিনিধিত্ব করে);ফ্লুরোসেন্ট রঞ্জকগুলির মধ্যে রয়েছে স্যাচুরেটেড ফ্লুরোসেন্ট রঞ্জক এবং নন-স্যাচুরেটেড ফ্লুরোসেন্ট রঞ্জক, নন-স্যাচুরেটেড ফ্লুরোসেন্ট রঞ্জকগুলির সাধারণ প্রতিনিধি হল SYBRGreen I, যা এখন সাধারণত ব্যবহৃত হয়;স্যাচুরেটেড অ-স্যাচুরেটেড ফ্লুরোসেন্ট রঞ্জকগুলির সাধারণ প্রতিনিধি হল SYBRGreenⅠ;স্যাচুরেটেড ফ্লুরোসেন্ট রঞ্জকগুলি হল ইভাগ্রিন, এলসিগ্রিন ইত্যাদি।

SYBRGreenI হল ফ্লুরোসেন্ট পিসিআর-এর জন্য একটি সাধারণভাবে ব্যবহৃত ডিএনএ বাইন্ডিং ডাই, যা অ-বিশেষভাবে ডবল-স্ট্র্যান্ডেড ডিএনএর সাথে আবদ্ধ করে।এর মুক্ত অবস্থায়, SYBRGreenI একটি দুর্বল ফ্লুরোসেন্স নির্গত করে, কিন্তু একবার ডবল-স্ট্র্যান্ডেড ডিএনএ-তে আবদ্ধ হলে, এর ফ্লুরোসেন্স 1000-গুণ বেড়ে যায়।অতএব, একটি বিক্রিয়া দ্বারা নির্গত মোট প্রতিপ্রভ সংকেত উপস্থিত ডাবল-স্ট্র্যান্ডেড ডিএনএ-এর পরিমাণের সমানুপাতিক এবং পরিবর্ধন পণ্য বৃদ্ধির সাথে সাথে বৃদ্ধি পায়।

ডাবল-স্ট্র্যান্ডেড ডিএনএ বাইন্ডিং রঞ্জকগুলির সুবিধাগুলি: সাধারণ পরীক্ষামূলক নকশা, শুধুমাত্র 2 টি প্রাইমার প্রয়োজন, প্রোব ডিজাইন করার প্রয়োজন নেই, একাধিক জিনের দ্রুত পরীক্ষার জন্য একাধিক প্রোব ডিজাইন করার প্রয়োজন নেই, গলনাঙ্কের বক্ররেখা বিশ্লেষণ করার ক্ষমতা, এর নির্দিষ্টতা পরীক্ষা করা পরিবর্ধন প্রতিক্রিয়া, কম প্রাথমিক খরচ, ভাল সাধারণতা এবং তাই দেশে এবং বিদেশে গবেষণায় আরও বেশি ব্যবহৃত হয়।

ফ্লুরোসেন্ট প্রোব পদ্ধতি (তাকমান কৌশল): যখন পিসিআর পরিবর্ধন করা হয়, তখন একটি নির্দিষ্ট ফ্লুরোসেন্ট প্রোবের সাথে এক জোড়া প্রাইমার যোগ করা হয়।যখন প্রোবটি অক্ষত থাকে, রিপোর্টার গ্রুপ দ্বারা নির্গত ফ্লুরোসেন্স সংকেতটি নিভে যাওয়া গ্রুপ দ্বারা শোষিত হয় এবং পিসিআর যন্ত্র দ্বারা সনাক্ত করা যায় না;পিসিআর পরিবর্ধনের সময় (এক্সটেনশন পর্বে), Taq এনজাইমের 5'-3' ক্লিভেজ কার্যকলাপ প্রোবকে এনজাইম্যাটিকভাবে অবনমিত করে, যা রিপোর্টার ফ্লুরোসেন্স গ্রুপ এবং quenched ফ্লুরোসেন্স গ্রুপ তৈরি করে

ফ্লুরোসেন্ট পরিমাণগত পিসিআর এর প্রয়োগ।

আণবিক জীববিজ্ঞান গবেষণা:

1. পরিমাণগত নিউক্লিক অ্যাসিড বিশ্লেষণ।সংক্রামক রোগের পরিমাণগত এবং গুণগত বিশ্লেষণ, প্যাথোজেনিক অণুজীব বা ভাইরাস সনাক্তকরণ, যেমন সাম্প্রতিক ইনফ্লুয়েঞ্জা A (H1N1) মহামারী, ট্রান্সজেনিক উদ্ভিদ ও প্রাণীর জিন কপি নম্বর সনাক্তকরণ, RNAi জিন নিষ্ক্রিয়করণ হার সনাক্তকরণ ইত্যাদি।

2. ডিফারেনশিয়াল জিন এক্সপ্রেশন বিশ্লেষণ।চিকিত্সা করা নমুনার মধ্যে জিনের অভিব্যক্তির পার্থক্যের তুলনা (যেমন ড্রাগ চিকিত্সা, শারীরিক চিকিত্সা, রাসায়নিক চিকিত্সা, ইত্যাদি), বিভিন্ন পর্যায়ে নির্দিষ্ট জিনের অভিব্যক্তির পার্থক্য এবং সিডিএনএ মাইক্রোয়ারে বা ডিফারেনশিয়াল এক্সপ্রেশন ফলাফলের নিশ্চিতকরণ

3. SNP সনাক্তকরণ।একক নিউক্লিওটাইড পলিমরফিজম সনাক্তকরণ বিভিন্ন রোগের প্রতি পৃথক সংবেদনশীলতা বা নির্দিষ্ট ওষুধের প্রতি পৃথক প্রতিক্রিয়া অধ্যয়নের জন্য গুরুত্বপূর্ণ, এবং আণবিক বীকনের উদ্ভাবনী কাঠামোর কারণে, একবার SNP-এর ক্রম তথ্য জানা গেলে, এটি সহজ এবং নির্ভুল। উচ্চ-থ্রুপুট SNP সনাক্তকরণের জন্য এই কৌশলটি ব্যবহার করুন।

4. মিথাইলেশন সনাক্তকরণ।মিথাইলেশন অনেক মানবিক রোগের সাথে, বিশেষ করে ক্যান্সারের সাথে যুক্ত, এবং লেয়ার্ড মেথিলাইট নামক একটি কৌশলের কথা জানিয়েছেন, যা পরিবর্ধনের আগে ডিএনএকে চিকিত্সা করে যাতে আনমিথাইলেড সাইটোসিন ইউরাসিল হয়ে যায় এবং মিথাইলেড সাইটোসিন প্রভাবিত হয় না, নির্দিষ্ট প্রাইমার এবং টাকমান প্রোব ব্যবহার করে মেথিলেটেড এবং আনমিথাইলেড এবং ডিএনএ এর মধ্যে পার্থক্য করা যায়। .আরো সংবেদনশীল।

মেডিকেল গবেষণা:

1. প্রসবপূর্ব নির্ণয়: মানুষ পরিবর্তিত জেনেটিক উপাদানের কারণে বংশগত রোগের চিকিৎসা করতে পারে না এবং এখন পর্যন্ত, তারা বিভিন্ন বংশগত রোগের সংঘটন রোধ করার জন্য প্রসবপূর্ব পর্যবেক্ষণের মাধ্যমে জন্মগ্রহণকারী অসুস্থ শিশুদের সংখ্যা কমাতে পারে।এটি একটি অ আক্রমণাত্মক পদ্ধতি যা গর্ভবতী মহিলাদের দ্বারা সহজেই গৃহীত হয়।

2. প্যাথোজেন সনাক্তকরণ: ফ্লুরোসেন্ট পরিমাণগত পিসিআর পরীক্ষাটি গনোকোকাস, ক্ল্যামাইডিয়া ট্র্যাকোমাটিস, মাইকোপ্লাজমা সোলিয়াম, হিউম্যান প্যাপিলোমা ভাইরাস, হারপিস সিমপ্লেক্স ভাইরাস, হিউম্যান ইমিউনোডেফিসিয়েন্সি ভাইরাস, হেপাটাইটিস ভাইরাস, মাইকোলোভাসিয়াম ভাইরাস, টিউবারোসিয়াম ভাইরাস, ইনফ্লুয়েনকোসিয়াম ভাইরাস এবং টিউবারোসিয়ামের মতো রোগজীবাণুগুলির পরিমাণগত নির্ধারণের অনুমতি দেয়।ঐতিহ্যগত পরীক্ষার পদ্ধতির তুলনায় এটির উচ্চ সংবেদনশীলতা, কম নমুনার আকার, দ্রুততা এবং সরলতার সুবিধা রয়েছে।

3. ওষুধের কার্যকারিতা মূল্যায়ন: হেপাটাইটিস বি ভাইরাস (HBV) এবং হেপাটাইটিস সি ভাইরাস (HCV) এর পরিমাণগত বিশ্লেষণ দেখায় যে ভাইরাল লোড এবং নির্দিষ্ট ওষুধের কার্যকারিতার মধ্যে সম্পর্ক।যদি HBV-DNA-এর সিরাম স্তর ল্যামিভিউডিন চিকিত্সার সময় হ্রাস পায় এবং তারপরে আবার বৃদ্ধি পায় বা পূর্বের মাত্রা ছাড়িয়ে যায়, তবে এটি ভাইরাস মিউটেশনের নির্দেশক।

4. অনকোজেনেটিক পরীক্ষা: যদিও টিউমারের বিকাশের প্রক্রিয়া এখনও স্পষ্ট নয়, তবে এটি ব্যাপকভাবে স্বীকৃত যে প্রাসঙ্গিক জিনের মিউটেশনগুলি অনকোজেনিক রূপান্তরের অন্তর্নিহিত কারণ।অনেক টিউমারের প্রাথমিক পর্যায়ে অনকোজিনের বর্ধিত প্রকাশ এবং মিউটেশন দেখা যায়।রিয়েল-টাইম ফ্লুরোসেন্স কোয়ান্টিটেটিভ পিসিআর শুধুমাত্র জিনের মিউটেশন শনাক্ত করতেই কার্যকর নয়, অনকোজিনের অভিব্যক্তিও সঠিকভাবে সনাক্ত করতে পারে।এই পদ্ধতিটি টেলোমারেজ hTERT জিন, ক্রনিক গ্রানুলোসাইটিক লিউকেমিয়া WT1 জিন, অনকোজেনিক ইআর জিন, প্রোস্টেট ক্যান্সার পিএসএম জিন এবং টিউমার-সম্পর্কিত ভাইরাল জিন সহ বিভিন্ন জিনের অভিব্যক্তি সনাক্ত করতে ব্যবহৃত হয়েছে।

www.DeepL.com/Translator (ফ্রি সংস্করণ) দিয়ে অনুবাদ করা হয়েছে